เชี่ยวชาญการวิเคราะห์ข้อมูล qPCR ใน Excel: 2 วิธีง่ายและพิสูจน์แล้ว

qPCR เป็นเทคโนโลยีขั้นสูงวัดปริมาณ DNA ในตัวอย่างโดยใช้ PCR qPCR ย่อมาจาก quantitative polymerase chain reaction 雖然เป็นกระบวนการขั้นสูง แต่เราสามารถ วิเคราะห์ qPCR data ใน Excel ได้ ในบทความนี้จะสาธิต สอง วิธีวิเคราะห์ qPCR data ใน Excel หากสนใจ ดาวน์โหลดสมุดงานฝึกฝนและทำตาม

ดาวน์โหลดสมุดงานฝึกฝนเพื่อฝึกขณะอ่านบทความนี้

qPCR Analysis คืออะไร?

qPCR หรือ quantitative polymerase chain reaction เป็นเทคโนโลยีขั้นสูงวัดปริมาณ DNA ในตัวอย่างโดยใช้ PCR (polymerase chain reaction) มี 2 วิธีวิเคราะห์ qPCR data

Double Delta Ct Method

ในปี 2001 Livak และ Schmittgen เรียกกระบวนการวิเคราะห์นี้ว่า Double Delta Ct method เป็นกรณีเฉพาะของ Pfaffl method ตามวิธีนี้ ต้องป้อนชุดข้อมูลทดลองเฉลี่ย สอง ชุด (Gene Tested Experimental และ Housekeeping Gene Experimental) และข้อมูลควบคุม (Gene Tested Control และ Housekeeping Gene Control) จากค่าเหล่านี้ จะได้ค่า ∆CTE และ ∆CTC ตามลำดับ

ค่า ∆CTE แสดงค่าลบของ Gene Tested Experimental (TE) และ Housekeeping Gene Experimental (HE) นิพจน์ทั่วไปของ ∆CTE คือ:

เช่นเดียวกัน ค่า ∆CTC แสดงค่าลบของ Housekeeping Gene Control (HC) จาก Gene Tested Control (TC) นิพจน์ทางคณิตศาสตร์คือ:

หลังจากนั้น ต้องประมาณค่า ∆∆Ct สูตรหาค่า ∆∆Ct คือ:

สุดท้าย ประเมิน Gene Expression Ratio ตามวิธีนี้ สมมติ Primer Efficiency สำหรับยีนทดลองและควบคุมเป็น 100% นิพจน์ของ Gene Expression Ratio คือ:

Pfaffl Method

Pfaffl method เป็นวิธีทั่วไปสำหรับ qPCR analysis คล้ายกับ Double Delta Ct method แต่ Primer Efficiencies ไม่ใช่ 100% สามารถเป็นค่าใดก็ได้ ปกติอยู่ระหว่าง 90% ถึง 110% สำหรับ House Keeping Gene (HKG) และ Gene of Interest (GOI) ในปี 2001 Michael Pfaffl เสนอสูตรนี้ในวารสาร Nucleic Acids Research

ในวิธีนี้ ต้องป้อนชุดข้อมูล 2 ชุด คำนวณค่าเฉลี่ย แล้วประมาณค่าเฉลี่ยตัวอย่างควบคุม จากนั้นหาค่า ∆Ct นิพจน์ของ ∆Ct คือ:

สูตรคณิตศาสตร์สำหรับวิเคราะห์ Gene Expression Ratio คือ:

2 วิธีง่ายในการวิเคราะห์ qPCR Data ใน Excel

ในบริบทนี้ จะวิเคราะห์ qPCR data สำหรับ สาม หรือ ห้า ตัวอย่าง จะทำ Double Delta Ct method ก่อน แล้วค่อย Pfaffl method

1. วิเคราะห์ qPCR Data ด้วย Double Delta Ct Method

สำหรับการวิเคราะห์ qPCR ด้วย Double Delta Ct method พิจารณาชุดข้อมูล ห้า ตัวอย่าง DNA ในวิธีนี้ ค่า PCR Primer Efficiencies สำหรับยีนทดลองและควบคุมเป็น 100% ยังอ้างได้ว่าเป็นกรณีเฉพาะของ Pfaffl method ขั้นตอนมีดังนี้:

📌 ขั้นตอน:

• ป้อนค่ายีนทั้งหมดอย่างแม่นยำตามภาพ ต้องป้อนค่าทดลองของ Gene Tested Experimental(TE) และ Housekeeping Gene Experimental(HE) ในคอลัมน์ B และ C ตามลำดับ ป้อนค่าควบคุมของ Gene Tested Control(TC) และ Housekeeping Gene Control(HC) ในคอลัมน์ D และ E ตามลำดับ

• ในเซลล์ F5 คำนวณ ∆CTE ใส่สูตร:

=B6-C6

• กด Enter

• ในเซลล์ G5 ประมาณ ∆CTC ใส่สูตร:

=D6-E6

• กด Enter

• ในเซลล์ H5 หา ∆∆Ct ใส่สูตร:

=F6-G6

• กด Enter

• ในเซลล์ I5 คำนวณ Gene Expression Ratio หรือ 2^(−∆∆Ct) ใส่สูตร:

=2^(-H6)

• กด Enter อีกครั้ง

• เลือกช่วง F6:I6

• ดับเบิลคลิก ที่ Fill Handle เพื่อคัดลอกสูตรถึงแถว 10
• จะได้ค่า Gene Expression Ratio สำหรับทุกตัวอย่าง

วิธีนี้ทำงานสมบูรณ์ สามารถวิเคราะห์ qPCR data ใน Excel ได้

🔍 การตีความผลลัพธ์

ค่า Gene Expression Ratio 0.6507 ในเซลล์ I5 หมายความว่า ตัวอย่างยีนใน เงื่อนไขทดสอบ เทียบกับ เงื่อนไขควบคุม ทั้งหมดถูกปรับให้ปกติ (normalized) ต่อ housekeeping gene สามารถมองเป็นเปอร์เซ็นต์ได้ 0.6507 = 65.07% gene expression ใน เงื่อนไขทดสอบ เทียบ เงื่อนไขควบคุม

อ่านเพิ่มเติม: วิธีวิเคราะห์ชุดข้อมูลขนาดใหญ่ใน Excel (6 วิธีที่มีประสิทธิภาพ)

บทความที่เกี่ยวข้อง

• วิธีวิเคราะห์ข้อมูลยอดขายใน Excel (10 วิธีง่ายๆ)
• [แก้ไข:] Data Analysis ไม่แสดงใน Excel (2 วิธีที่มีประสิทธิภาพ)
• วิเคราะห์ข้อมูล Likert Scale ใน Excel (ขั้นตอนเร็ว)
• วิเคราะห์ข้อมูลเชิงคุณภาพจากแบบสอบถามใน Excel

2. วิเคราะห์ qPCR ด้วย Pfaffl Method

ในวิธีนี้ ใช้ Pfaffl method ความต่างหลักจาก Double Delta Ct method คือ ค่า PCR Primer Efficiencies สำหรับยีนทดลองและควบคุม ไม่ใช่ 100% ในตัวอย่างนี้ สมมติค่า Primer Efficiency สำหรับทั้งสองกรณี สำหรับ House Keeping Gene สมมติ 93% สำหรับ Gene of Interest คือ 101% ขั้นตอนมีดังนี้:

📌 ขั้นตอน:

• ป้อนค่ายีนทั้งหมดอย่างแม่นยำ ตามภาพ ต้องป้อนค่า treated และ control ของ House Keeping Gene (HKG) และ Gene of Interest (GOI) ทั้งสองชุด ยีนแต่ละชุดเรียกว่า Ct-1 และ Ct-2 ตามลำดับ

• คำนวณส่วน House Keeping Gene (HKG) ก่อน
• หาค่าเฉลี่ยของทั้งสองชุด ใช้ ฟังก์ชัน AVERAGE
• ในเซลล์ E6 ใส่สูตร:

=AVERAGE(C6:D6)

• กด Enter

• ดับเบิลคลิก Fill Handle คัดลอกสูตรถึง E11

• ประมาณค่าเฉลี่ยของค่า สาม ค่าควบคุม
• ในเซลล์ผสาน F6 ใส่สูตร:

=AVERAGE(E9:E11)

• กด Enter

• เลือกเซลล์ G6 ใส่สูตรหา ∆Ct ใช้ Absolute Cell Reference สำหรับ F6

=E6-$F$6

• กด Enter

• ดับเบิลคลิก Fill Handle คัดลอกสูตรถึง G11
• คำนวณ House Keeping Gene (HKG) เสร็จสิ้น

• ทำกระบวนการเดียวกันสำหรับส่วน Gene of Interest (GOI)

• ในเซลล์ O6 ใส่สูตรหา expression ratio ใช้ Absolute Cell Reference สำหรับ N6 และ H6

=($N$6^M6)/($H$6^G6)

• กด Enter ครั้งสุดท้าย

• ดับเบิลคลิก Fill Handle คัดลอกสูตรถึง O11
• ได้ค่า expression ratio สำหรับทุกตัวอย่าง

วิธีนี้ทำงานสำเร็จ สามารถวิเคราะห์ qPCR data ใน Excel ได้

สรุป

จบบทความนี้ หวังว่าจะเป็นประโยชน์ และคุณจะวิเคราะห์ qPCR data ใน Excel ได้ โปรดแชร์คำถามหรือข้อเสนอแนะในส่วนความคิดเห็น

อย่าลืมเยี่ยมชม ExcelDemy สำหรับปัญหาและโซลูชัน Excel ต่างๆ เรียนรู้วิธีใหม่ๆ และพัฒนาต่อไป!

บทความที่เกี่ยวข้อง

• วิเคราะห์ข้อมูลใน Excel ด้วย Pivot Tables (9 ตัวอย่าง)
• วิเคราะห์ Time-Scaled Data ใน Excel (ขั้นตอนง่ายๆ)
• วิเคราะห์ข้อมูลเชิงคุณภาพใน Excel (ขั้นตอนง่ายๆ)
• ทำ Case Study ด้วยการวิเคราะห์ข้อมูล Excel
• วิธีวิเคราะห์ข้อมูลข้อความใน Excel (5 วิธี)